200kd的大蛋白western blot的實(shí)驗

A1：首先使用6-8%的分離膠，其次電轉(zhuǎn)時間適當(dāng)延長，250mA，90分鐘左右。如果同時需要跑一些分子量小的蛋白，最好將大小兩種膜分開轉(zhuǎn)膜

A2：注意以下問題：1、 緩沖液中加甲醇的作用是使SDS游離出來，并增加膜結(jié)合蛋白的量，但過多的甲醇會使膠收縮，造成大分子在凝膠中的沉淀而降低轉(zhuǎn)膜效率。大分子量的蛋白質(zhì)（如大于60kDa）應(yīng)使用低濃度的甲醇或不使用甲醇。

2、 電轉(zhuǎn)移效果檢查方法：①考馬斯亮蘭染色電轉(zhuǎn)移后的凝膠，檢查是否還有蛋白質(zhì)存留；②麗春紅染色，檢查膜是否吸附了蛋白質(zhì)。

3、 濕式電轉(zhuǎn)方法效率高，半干式電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移速度較快。

4、 阻斷劑有BSA、Tween-20、脫脂奶粉和其他動物的血清等多種，阻斷的效果不盡相同，如果實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)背景過高，可以嘗試更換阻斷劑。

5、 一抗和酶標(biāo)二抗的濃度十分重要，濃度過高，造成背景過高；濃度過低造成靈敏度偏低，實(shí)驗中應(yīng)根據(jù)一抗和酶標(biāo)二抗的效價，對此參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。此外，一抗的質(zhì)量十分關(guān)鍵，抗體特異性和效價直接影響實(shí)驗結(jié)果。

6、 須嚴(yán)格控制假陽性反應(yīng)，可使用免疫前血清作為陰性對照，同時要以抗原作為絕對的陽性對照，準(zhǔn)確確定陽性條帶的位置。

A3：6%左右的膠，電泳的話得試一下，80V，先跑半小時，然后100V跑半小時，0.45mm 的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜普通轉(zhuǎn)膜液350MA，90分鐘左右