protocol 分享｜病毒感染細胞前準備（293T 包裝病毒）

原理

以慢病毒包裝為例，主要包括 3 個質(zhì)粒：質(zhì)粒 DNA 可以轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)（RNA），但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒，其同時含有目的基因和報告基因，psPAX2 是可以表達慢病毒外殼的質(zhì)粒，其表達產(chǎn)物可通過粘附機制更易穿過細胞膜。

pMD2.G 為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體進行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細胞基因組中，宿主基因組在表達時，隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因 RNA 與 psPAX2、pMD2.G 基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。病毒進入細胞后，其遺傳物質(zhì) RNA 逆轉(zhuǎn)錄出 DNA，該基因再整合到靶細胞的基因組中，完成轉(zhuǎn)染過程。

因為質(zhì)粒 DNA 只能轉(zhuǎn)錄出病毒 RNA 和表達目的基因卻不能表達出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細胞能反復(fù)增殖，故對宿主細胞是無害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)染到靶細胞基因組中。

用途

病毒產(chǎn)生，包裝病毒。

材料與儀器

無菌 1 × PBS，對數(shù)期 293T 細胞，細胞計數(shù)器，病毒質(zhì)粒（以慢病毒為例：psPAX2/pMD2.G/載體質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染試劑（lipMax 或者 lipo3000），Poly brene、病毒濃縮液（生物公司有售）等。

步驟

（1）293T 細胞鋪板

取對數(shù)生長期的 293T 細胞，用 0.05% 的胰蛋白酶消化 293T 細胞，計數(shù)。

若是 10 cm 大皿，建議按照 10-12 × 106 每皿的數(shù)量將 293T 細胞均勻鋪入。

若是 6 孔板，建議按照 2 × 106 每孔的數(shù)量將 293T 細胞均勻鋪入。

（2）第二天：在 24 小時之內(nèi)，觀察 293T 細胞的匯合度在 90%~95% 之間時，向其中加入 DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體，DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體制備方法如下：

a）輕輕混勻 LipoMax，根據(jù)說明書加入相應(yīng)量于 500 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中，混合均勻并置于室溫 5 分鐘。

b）在 500 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中稀釋 DNA，總質(zhì)量為 15 μg 按照載體質(zhì)粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1 的比例加入 DNA。

c）將稀釋后的 LipoMax 和稀釋后的 DNA 輕輕混勻，常溫靜置 20 分鐘，形成 DNA-LipoMax 復(fù)合體。

（3）將 DNA-LipoMax 復(fù)合體輕柔地滴加至細胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（4）病毒收集

濃縮病毒：加入 DNA-LipoMax 復(fù)合體 48 小時后，收集病毒上清，同時加入 10 ml 預(yù)溫的 293T 培養(yǎng)基到細胞培養(yǎng)皿中。

將收集到的病毒上清存在 4 ℃ 冰箱中；收集 72 小時病毒上清，與 48 小時病毒上清混在一起。將離心機溫度降溫到 4 ℃，600 g，離心 5 分鐘，去除其中的細胞碎片，上清液經(jīng) 0.45 μm 濾頭過濾，加入病毒濃縮液，配制濃縮病毒液。

將濃縮后的病毒放于 4 ℃ 冰箱搖床上，旋轉(zhuǎn)過夜。第二天，4 度離心機，3000~4000 g 離心 15 分鐘。棄掉上清液，加入 1Xpbs 或培養(yǎng)基重懸。

注意事項

1. 病毒包裝的幾個關(guān)鍵點主要包括：細胞因素、載體系統(tǒng)（盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng)）、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制（24、48 小時的細胞及熒光狀態(tài)判斷）、目的基因?qū)Σ《景b影響 (基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功）。

2. 293T 細胞狀態(tài)和鋪板時候的緊密會影響病毒包裝效率，需要觀察包裝病毒后的 48 h 培養(yǎng)基顏色是否橙紅。

3. 病毒濃縮：病毒一般在 48 h 和 72 h 各收一次。如果不想濃縮病毒的話，也可以直接將收集的病毒上清作為要感染的細胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會不太好。并且一般收病毒時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)已經(jīng)損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)感染細胞會損害細胞，所以建議還是進行濃縮后再感染。

常見問題

1. 包裝病毒時 293T 細胞狀態(tài)不好，或者鋪得過密，可以選擇放棄該次實驗。

2. 目的載體過大，不易感染。

3. 避免轉(zhuǎn)染過程以及后續(xù)感染過程出現(xiàn)的污染。